1 背 景
脑血管病是全球第二大常见死因,也是成年人最主要的致残原因^[1]。随着老龄化社会的发展,脑血管病的发病率逐渐增高^[2]。其中,ICVD( Ischemic cerebrovascular disease)占脑血管病的87%^[3]。目前,药物溶栓和血管内介入治疗-----------------------------------------------
是公认的治疗ICVD的有效方法^[4]。但溶栓治疗时间窗短暂,仅为3～4.5 h^[5],因此只有约5%的ICVD患者成功接受溶栓治疗^[6]。血管内介入治疗后2年内脑卒中再发率明显高于药物溶栓^[7]。所以,对于无溶栓适应症和血管内介入指征的ICVD患者需要寻求其他方法。近年来,新提出的生物疗法为ICVD的治疗提供了一个新的方向。研究表明EPCs( endothelial progenitor cells)可以促进血管再生及神经修复,且EPCs的水平与ICVD的严重程度呈负相关^[8]。因此,基于EPCs为ICVD的治疗提供了一个新的思路。
2 内皮祖细胞的起源、生物学特性和表面特征
EPCs主要来源于骨髓、脾、外周血和脐带血,其中骨髓中EPCs含量丰富^[9]。将外周血中EPCs在体外培养,根据生长周期将其分为早期EPCs和晚期EPCs。早期EPCs呈梭形,3～5 d出现,约第4周死亡,增殖能力低,能分泌血管内皮生长因子和白介素-8等细胞因子促进血管新生。晚期EPCs呈鹅卵石样,培养2～3周出现,4～8周生长达顶峰,能在培养基中存活长达12周,主要通过增殖分化形成成熟血管内皮细胞,参与血管新生^[10]。EPCs表面标志目前尚不十分明确,主要包括造血干细胞标志CD34和CD133,内皮细胞表面标志如CD31、KDR、vWF、CD144、Tie2,c-kit/CD117和E-选择素等^[10-13]。由于EPCs处于干细胞向内皮细胞的分化阶段,其表面标志处于动态变化中,所以研究倾向于使用CD34/VEGF R2 /CD133 三阳性细胞表面标记鉴定EPCs^[14]。
3 EPCs在ICVD治疗中的作用机制
ICVD主要是由于脑组织局部血液循环受阻及神经元坏死而造成难以逆转的功能破坏。EPCs主要通过参与血管再生和神经修复来促进ICVD恢复。Zhang等^[15]首次提出内源性EPCs在ICVD中参与新血管形成。在ICVD急性期EPCs分泌多种细胞因子促进更多的EPCs向缺血灶迁移; 进入ICVD亚急性期EPCs主要以血管发生和血管生成两种方式来促进血管新生。一方面,骨髓中的EPCs在细胞因子的作用下动员到外周血中,迁移、增殖、分化形成内皮细胞,再从头形成血管网的过程即为血管发生; 另一方面,EPCs通过分泌多种细胞因子激活静止的内皮细胞,使内皮细胞以出芽或非出芽方式形成新的毛细血管,此过程即为血管生成。研究表明,新生血管内皮细胞中约26%来源于EPCs^[16]。ICVD中血管新生常常伴随着神经再生,目前对于EPCs促进血管和神经修复的机制尚不完全清楚,可能有以下几个方面:①EPCs促进血管新生,为神经再生提供营养物质; ②脑缺血发生后EPCs能动员脑组织现存的神经祖细胞沿新生血管迁移,代替受损的神经细胞^[17]; ③EPCs可通过抑制细胞凋亡和氧化应激反应,减轻神经元损伤^[18]; ④EPCs通过旁分泌作用生成的血管内皮生长因子不仅能促进血管新生,还能将星形胶质细胞转化为神经细胞,形成新的血管神经网^[19]; ⑤Mao等^[20]用CXCR4拮抗剂AMD3100处理大脑中动脉阻塞的动物模型后发现缺血区EPCs数量下降,毛细血管密度和脑血流量均不同程度的减少,据此推测EPCs通过CXCR4/SDF-1轴来参与新血管形成。
4 以EPCs为基础的治疗策略
以EPCs为基础的治疗策略分为内源性EPCs的动员和外源性EPCs的移植,现从这两方面展开阐述。
4.1 内源性EPCs的动员
ICVD发生后内源性EPCs主要从骨髓动员至外周血^[21]。由于内源性EPCs在体内的数量很少,尤其是病理状态下内源性EPCs数量和功能均会下降^[22]。通过内源性途径治疗ICVD,其策略是促进、激活生理性存在于体内的EPCs增殖、迁移和分化,避免了细胞移植中有关的伦理道德、异源性细胞致病性及移植细胞致瘤性等问题。临床上促进EPCs动员的最常见药物是他汀类药物,其机制可能是通过他汀类药物促进内皮型一氧化氮合酶的合成而使一氧化氮增加有关^[23]。血管紧张素Ⅱ是通过与EPCs表面的1型血管紧张素II受体结合来诱导凋亡信号通路,所以血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素阻滞剂类药物可以增加EPCs的数量和改善其功能^[24-25]。Stenmetz等^[26]发现联合应用替米沙坦和辛伐他汀比使用单一药物对EPCs的数量增加和功能改善有更加显著的作用,据此推测他汀类药物和沙坦类药物联合使用时对EPCs数量增加和功能改善有协同作用。De Ciuceis等^[27] 在观察降压药对EPCs数量的影响时给2组患者分别给予巴尼地平20 mg、氢氯噻嗪25 mg,6月后2种药物对于患者的降压效果相同,但巴尼地平能够增加循环EPCs的数量,而氢氯噻嗪不能,据此推测钙离子通道阻滞剂可能增加EPCs的数量,其机制可能与其促进血管平滑肌细胞释放血管内皮生长因子和清除氧自由基有关。Sheu等^[28]对55例肢体严重缺血的患者给予氯吡格雷和西洛他唑治疗,3个月肢体疼痛明显改善,并且其血循环中EPCs数量明显增加。西洛他唑单独使用也可增加循环EPCs的数量,促进脐血来源的EPCs迁移和粘附^[29]。胞二磷胆碱作为神经内科常用的神经保护剂,单独注射或与rt-PA同时注射均可增加急性脑血管病患者血循环中EPCs的数量^[30]。Zhao等^[31]通过170例患者的临床研究证实丁苯酞注射液不仅能有效改善急性缺血性脑卒中患者神经功能缺损,还能促进EPCs动员,增加循环EPCs的数量。粒细胞集落刺激因子是细胞因子家族中的成员,其主要功能是刺激粒、单核巨噬细胞成熟,促进成熟细胞向外周血释放。动物实验证实,粒细胞集落刺激因子还能动员骨髓干细胞进入外周血并促进脑组织基质细胞衍生因子表达以趋化干细胞,促进脑组织的血管再生和神经修复,继而改善大脑中动脉阻塞后大鼠神经功能缺损症状^[32]。临床研究也证实,静脉给予粒细胞集落刺激因子,刺激EPCs动员至周围血循环中,可使冠心病患者血循环中的EPCs数量增加^[33]。在ICVD患者中粒细胞集落刺激因子可动员CD34+骨髓干细胞至周围血循环中,并改善患者美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)和改良Rankin量表(MRS)^[34]。此外,促红细胞生成素(erythopietin,EPO)因具有神经保护作用曾认为可以用于ICVD的治疗^[35]。但在德国进行的一项多中心大样本临床试验中对522例ICVD患者用rt-PA静脉溶栓后6、24或48 h使用EPO,显示EPO非但不能改善ICVD发病后3个月的Barthel指数,反而会增高其病死率^[36]。然而,最新一项临床试验表明EPO治疗可以增加循环EPCs的水平,并且能够改善3个月后的Barthel指数^[37]。动物实验也证实,EPO能动员EPCs至周围血,促进血管生成^[38]。所以,EPO是否能够用于ICVD的治疗,目前还需要进一步的临床试验去评价其有效性和安全性。
4.2 外源性EPCs移植
4.2.1 外源性EPCs移植现状
基于EPCs在ICVD中的治疗作用,EPCs移植可能成为治疗ICVD的新方法。动物实验表明,CD34+细胞移植在ICVD后对促进新血管形成和神经再生有治疗作用^[39]。Moubarik等^[40]在小鼠大脑中动脉闭塞模型中向缺血损伤区注射人脐血源性的EPCs同种亚型细胞即内皮克隆形成细胞(endothelial colony-forming cells, ECFCs)24 h后发现,用荧光标记的ECFCs定位于大脑缺血区,14 d发现注射ECFCs的大鼠神经功能较对照组大鼠有明显改善。另一项动物实验表明,EPO结合脐带血源性的ECFCs移植较单独注射EPO或者人脐带血源性的ECFCs更有利于抑制细胞凋亡,促进血管和神经再生,改善ICVD的预后^[41]。此外,在EPCs移植前在体外对移植EPCs进行基因修饰的预处理能够增强其治疗效果^[42]。目前,修饰后的EPCs移植尚未应用于脑缺血动物实验中,因此为进一步脑缺血的动物实验研究提供了一个新的方向。
4.2.2 EPCs移植的安全性和有效性
虽然EPCs的移植在动物实验模型中取得了一定的效果,但仍存在一些问题。由于EPCs可以产生趋化因子白细胞介素-8及单核细胞趋化蛋白-1, 并且招募更多的单核细胞和巨噬细胞,这些都会加重缺血性脑损伤^[40]; 产生血管内皮生长因子,它在促进血管和神经再生的同时还增加血管的通透性,加重脑水肿^[43]; EPCs还可以迁移至肿瘤组织促进肿瘤组织血管形成,加快肿瘤增长^[44]。但是,在对55例行EPCs移植的急性心肌梗死患者长达5年的随访中并未发现有肿瘤形成^[45]。动物实验中习惯经静脉、动脉和经颅途径进行EPCs移植,由于动脉内注射容易形成血栓,经颅途径移植手术复杂,并且易造成脑出血等并发症,所以临床上移植首先考虑经静脉途径移植。此外,移植浓度和移植时间对于移植效果有重要意义,但目前在此方面研究很少。最近台湾进行的一项动物实验显示,与低浓度(1.7×10⁶/kg)相比,给家兔动脉注射高浓度(5.7×10⁶/kg)骨髓来源EPCs时能显著减少大脑梗死面积和改善其神经功能缺损的程度^[46]。在体外分别检测ICVD急性期和亚急性期的EPCs功能时发现,亚急性期的EPCs的血管形成能力更强,据此推测在ICVD亚急性期进行细胞移植可能比急性期更有效。EPCs在ICVD治疗中的作用仍需进一步探索和验证。
5 展 望
大量研究证实EPCs在ICVD的治疗中有重要意义,EPCs在缺血后脑组织血管再生和神经保护的作用已得到证实,但是在ICVD中EPCs的增殖、迁移和修复作用的机制还不完全清楚。关于EPCs作为ICVD治疗中的研究还停留在动物模型试验阶段,还需要更多的动物实验和临床试验去证实其有效性和安全性。除了在治疗方面的意义,EPCs在ICVD的诊断和预后中也有重要意义,EPCs在预防ICVD方面或许是一个新的研究方向。因此,EPCs在ICVD中的作用还需要进一步探讨。