血管性痴呆(VD)是指由脑血管疾病所引起与学习记忆认知功能障碍有关综合征<sup>[1]</sup>。我国VD 的患病率为逐年上升,严重影响中老年人的生活质量<sup>[2]</sup>。深入阐明血管性痴呆发生的病理生理生理机制为临床治疗寻找有效的干预措施极为重要。
超极化激活环核苷酸门控阳离子(hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated cation channels,HCN)通道是电压门控通道超家族中的一员,自上世纪末被发现以来,一直是神经科学工作者研究的热点课题。HCN 通道在中枢神经系统分布极为广泛,对神经元兴奋节律、神经网络振荡、树突整合、突触可塑性、递质释放等均有重要的调节作用<sup>[3]</sup>。分子生物学研究已发现HCN通道有4个亚型(HCN1-HCN4)<sup>[4]</sup>,在啮齿类动物的中枢神经系统均有广泛分布,其中HCN1在海马、前额皮层等表达最为丰富<sup>[5]</sup>。文献报道,HCN 通道参与学习和记忆的形成过程,HCN1 缺失可引起学习记忆功能损伤,其机制可能与树突整合有关<sup>[6]</sup>。然而,在脑缺血诱发的血管性痴呆情况下HCN1在海马CA1发生怎样的变化尚未见报道。
本研究采用双侧颈总动脉永久性结扎(2VO)制备慢性脑低灌性脑缺血模型,评价HCN1通道亚型在海马CA1区的蛋白表达水平的改变,进一步探究2VO大鼠海马CA1区HCN通道对学习记忆功能的调节作用,为血管性痴呆的防治提供新的干预靶点。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
水合氯醛,粉剂,购于国药集团化学试剂有限公司(货号:30037527,批号:20141011),HCN1抗体(生产厂家:Novus(诺伟司); 货号:NBP1-20250, 实验时稀释比例为1:800),所用其它试剂均为市售分析纯。
1.2 实验动物
SD 大鼠,雄性,清洁级(2～3月龄,体质量220～250 g),由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供(合格证编号:SCXK(E)2010-0009,No.42000600005370)。大鼠分笼饲养,自由进食,饮水,昼夜交替12 h,室温控制在(25±5)℃,适应性喂养1周后进行实验。将大鼠随机分成假手术组,2VO模型组。所有大鼠实验操作均按华中科技大学动物伦理委员会有关条例规定执行。
1.3 方法
1.3.1 慢性脑低灌注模型的制备
大鼠称重,水合氯醛(350 mg/kg, ip)麻醉,切开颈部皮肤,钝性分离双侧颈总动脉,用4-0手术缝线结扎双侧颈总动脉的近心端和远心端并剪断,即2血管永久性结扎(2VO),制备慢性脑低灌注缺血模型。假手术组大鼠仅暴露双侧颈总动脉,不结扎。在整个手术期间大鼠体温保持在(37.5± 0.5)℃,待大鼠清醒后单笼饲养。 大鼠2VO 4周后应用Morris水迷宫(MWM)实验评估各组大鼠空间学习记忆能力及取脑进行免疫组化和分子生物学实验。
1.3.2 Morris水迷宫实验
用于评价大鼠的空间学习记忆能力; 实验时将大鼠放入一圆柱形水槽[直径2 m,高35 cm,水深为21 cm,水温(25±3)℃]内; 水槽平面分为4个象限,将一直径为8 cm,高20 cm 的玻璃平台置于第Ⅱ象限; 实验于每天上午10:00～12:00 进行; 每只大鼠每天进行4 次,每次随机从1个象限入水1次,连续5 d,记录每天大鼠找到平台的时间,4个象限记录的时间的平均值作为逃逸潜伏期(评价大鼠空间学习能力); 实验第6 d撤去平台,记录大鼠在60 s 内在原平台放置象限(第Ⅱ象限,即为目标象限)的停留时间,作为评价空间记忆能力; 大鼠游泳轨迹采用成都泰盟科技有限公司MT-200水迷宫图像追踪系统视频监测。
1.3.3 免疫组织化学染色
水迷宫实验结束后每组取3只大鼠麻醉,用4%多聚甲醛的PBS对大鼠进行灌流后断头取脑,快速冰冻切片(40 μm); 脑片用0.3% Triton X-100的PBS进行漂洗,随后用5%的BSA封闭,4 ℃过夜孵育一抗anti-HCN1(MAB1572, Millipore; 1:800浓度),一抗孵育洗涤后室温孵育二抗2 h,二抗分别为DyLight 488 Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(A23210-1, Abbkine, 1:200浓度),二抗孵育后用Olympus Fluo View 1200共聚焦显微系统拍照(放大倍数400×)。
1.3.4 蛋白印迹实验
水迷宫实验结束后每组取7只大鼠麻醉迅速断头,分离海马,冰冻切片(厚400 μm ),进一步在体视显微镜下分离出CA1区组织,用膜蛋白试剂盒提取海马CA1区膜蛋白; 应用BCA 试剂盒测定蛋白水平。取80 μg提取液,用10% SDS/PAGE电泳后将蛋白转移至PVDF 膜,5%脱脂牛奶封闭1 h, TBST漂洗3次,各5 min; anti-HCN1(1:800), 用0.1% Tween-20 TBST 漂洗3 次(3×5 min),将PVDF膜室温下在HRP标记的二抗中孵育1 h; 用0.1% Tween-20 TBST漂洗3次(3×5 min),曝光,用NIH Image J 统计软件测定蛋白条带光密度值。
1.3.5 统计学处理
所有计量资料以均数±标准误(mean±SEM)表示,运用one/two-way ANOVA分析组间差异,<i>P</i><0.05表示显著性差异。
2 结 果
2.1 大鼠慢性脑低灌注对学习记忆功能损伤的影响
水迷宫实验显示,假手术组与缺血组大鼠的游泳速度无显著差异(<i>P</i>>0.05)。缺血组与假手术组相比,缺血组大鼠找到平台的潜伏期,显著延长(<i>n</i>=10,<i>P</i><0.05)(图1)。空间记忆实验显示,大鼠在目标象限(第Ⅱ象限:Q2)的停留时间占总时间的百分率作为评估记忆残留的指标。假手术组大鼠在目标象限Q2的停留时间显著长于缺血大鼠(假手术组:39.53±5.08%,缺血组:20.19±5.03%, <i>P</i><0.01)(图2)。
图1水迷宫实验第1 d到第5 d 2组大鼠找到平台的潜伏期 与假手术组大鼠相比,缺血组大鼠的潜伏期显著延长(<i>n</i>=10)
图2水迷宫实验第6 d大鼠空间记忆能力检测 与假手术组相比,缺血组大鼠在靶标象限停留的时间显著缩短(<sup>*</sup><i>P</i><0.01)
2.2 慢性脑低灌注大鼠海马CA1区HCN1表达水平的变化
免疫组化实验显示,大鼠慢性脑低灌注4周后HCN1蛋白在海马CA1区神经细胞的表达明显减少(图3)。
图3大鼠海马CA1区HCN1和HCN2组织化学染色(×400倍)
经蛋白印迹实验结果显示,2VO 4周后海马CA1区神经元HCN1膜蛋白表达显著减少(<i>n</i>=5, 与假手术组相比,<i>P</i><0.05)(图4)。
图42组大鼠海马CA1区HCN1蛋白表达水平变化 与假手术组比较,<sup>*</sup><i>P</i><0.05
3 讨 论
以脑组织供血不足为病理特征而导致认知功能障碍称为血管性痴呆,是痴呆发生的另一重要原因,临床发现其发病率仅次于老年性痴呆。本研究发现,大鼠双侧颈总动脉永久性结扎4周后在空间学习记忆能力明显受损时海马CA1 区HCN1表达水平显著降低,提示HCN1通过亚型可能参与慢性脑低灌注所致学习记忆损伤的病理调节过程。
超极化激活环核苷酸门控阳离子(HCN)通道是电压门控通道超家族中的一员,其包含HCN1-4 四种亚型,广泛分布于心脏和神经系统。大量研究表明,在正常大鼠海马HCN1亚型与其他几种亚型共同介导产生Ih电流。电生理记录显示,Ih存在于少数突触前膜,对突触传递的调控有重要作用。有研究报道在小龙虾运动神经元终板当cAMP依赖性的Ih表达上调,突触传递发生长时程易化,而突触传递发生长时程易化是学习记忆形成的电生理基础<sup>[7]</sup>。Phillips等报道Ih参与突触整合和传递、而影响学习记忆的形成和巩固<sup>[8]</sup>。近年来,研究还发现与癫痫<sup>[9]</sup>、阿尔茨海默病<sup>[9]</sup>、帕金森综合症<sup>[10]</sup>、神经性疼痛、精神情感障碍等疾病的发生、发展有较为密切的联系<sup>[11]</sup>。
HCN通道功能受细胞内cAMP水平调控, cAMP结合到通道的特定结合域(CNBD)上加速通道的开放<sup>[12]</sup>。在正常大鼠海马HCN1亚型介导产生Ih电流对突触传递的调控有重要作用。而在脑缺血缺氧的情况下由于缺血缺氧,细胞内cAMP水平减少, HCN通道功能减弱。本研究结果发现,海马CA1区HCN1蛋白表达下调,神经元的Ih电流减弱,可能引起整个海马神经突触传递发生改变,而导致海马依耐性的空间学习记忆功能受损。HCN1亚型参与介导的相关作用机制还有待进一步深入研究。