《卒中与神经疾病》杂志  2016年03期 154-156   出版日期：2016-06-24   ISSN:1007-0478   CN:42-1402/R

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 L-选择素在缺血性脑卒中患者外周血中的表达及其意义


 流行病学研究表明,中国每年有150万～200万新发脑卒中的病例^[1]。随着人口老龄化和经济水平的快速发展及生活方式的变化, 缺血性脑卒中发病率明显上升,严重威胁人们的生存质量及生命安全。近十几年, 脑卒中发病机制研究已获得诸多进展,炎性损伤机制在缺血性脑损伤中的作用受到广泛关注。其中炎性细胞浸润和相应细胞因子分泌在缺血性脑损伤中发挥着极为重要的作用^[2]。炎症细胞因子L-选择素是细胞黏附分子选择素家族的成员之一,它参与了白细胞的活化、炎症和创伤等过程,可使白细胞活化、变形,沿内皮细胞表面滚动、迁移并黏附于内皮细胞上^[3],还可以通过与配体或者抗体的交联作用释放炎症介质介导炎症反应^[4]。因此,本研究对缺血性脑卒中患者外周血中L-选择素的表达进行检测,初步探讨L-选择素和缺血性脑卒中的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象 选择2014年3月-2015年8月在本院进行住院治疗的缺血性脑卒中患者50例作为病例组,所选患者均符合中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010 的诊断标准^[5],并经头颅CT或MRI检查证实,其中,男23例、女27例,年龄(54.5±7.3)岁。同期选择到我院进行体检的正常健康体检者50例作为对照组,其中,男22例、女28例,年龄(52.8±9.7)岁。所有研究对象在采血前1个月内无任何感染性疾病,2组性别、年龄等临床资料具有可比性(P>0.05)。
1.2 方法
1.2.1 设计及合成引物 根据GenBank中查阅的基因序列,运用primer5.0软件设计,引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶( GAPDH)为内参。
L-选择素引物序列为:上游为5’-ACAGTCAGCCGC ATC TTCTTT-3’,下游为5’-CCATCACGCCACAGTTTCC-3’,扩增片段长度为651 bp; GAPDH引物序列为:上游为5’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3’,下游为5’-CCATCACGCCACAGTTTCC-3’,扩增片段长度为599 bp。
1.2.2 采集标本 所有研究对象均于清晨采集空腹外周静脉血2 mL,置于EDTA-k2抗凝管中摇匀备用。
1.2.3 提取总RNA 严格参照RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒(离心柱型,目录号DP433,天根有限公司)说明,在4 h内提取外周血总RNA,并置于-80 ℃冰箱保存。
1.2.4 逆转录RNA 采用Fermentas公司生产的RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit#K1622逆转录试剂盒,并严格参照说明书操作。反应体系为20 μL,操作步骤及反应条件:加入模板RNA 10 μL,oligo(dT)18 primer 1 μL,Rnasefree-H₂O 1 μL,放入梯度PCR仪65 ℃ 5 min后取出,再加入5×Reaction Buffer 4 μL,RiboLock RNase Inhibitor 1 μL,10 mM dNTP Mix 2 μL,RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL,再放入梯度PCR仪42 ℃ 60 min。逆转录成的cDNA放于-20℃保存。
1.2.5 PCR扩增反应体系 以GAPDH基因为内参,反应体系共25 μL,其中模板cDNA 1 μL,上下游引物各1 μL,RNAsefree-H₂O 10 ml,2×Taq PCR Master Mix 12 μL。反应条件:94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,61.5 ℃(内参为58 ℃)退火30 s,72 ℃延伸30 s,40个循环后,最后72 ℃延伸5 min。
1.2.6 电泳及半定量分析 取目的基因与内参的扩增产物各5 μL,置于同一块1.5%的琼脂糖凝胶上分孔电泳35 min,电压120 V; 电泳结束后采用Bio-Rad凝胶图像分析仪对琼脂糖凝胶拍照并保存; 采用Quantity One4.5.0软件对琼脂糖照片上的特异性条带进行灰度扫描,以GAPDH产物作校正,计算目的基因与内参GAPDH的灰度比。
1.2.7 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件,数据以均数±标准差((-overx)±s)表示,数据比较采用成组t检验方法,P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 总RNA的鉴定 全血总RNA用经紫外分光光度计检测,OD₂₆₀/OD₂₈₀比值均在1.8～2.0,表明所提RNA的纯度较高,蛋白质和DNA 污染少。从凝胶电泳上可以清晰看到28S、18S、5S RNA三条带。图1。
2.2 2组L-选择素的表达水平比较 病例组L-选择素表达的灰度比为2.96±0.71,对照组为1.22±0.46,2组比较有明显差异(P<0.01)。在凝胶电泳图上可以清晰的看出,L-选择素在病例组中的条带亮度强于对照组。图2。
图1全血总RNA凝胶电泳

图2从右向左看,1泳道为Marker,2-12泳道为病例组L-选择素和GAPD的RNA表达水平,13-19泳道分别为对照组L-选择素和GAPDH的RNA表达水平

3 讨 论
缺血性脑卒中是脑部血管狭窄或管腔闭塞等原因引起的脑部血液供应障碍,使局部脑组织发生不可逆性损害,导致脑组织缺血、缺氧性坏死的一种疾病。近十几年来,很多研究表明炎症与缺血性脑卒中密切相关,炎症可通过促进动脉粥样硬化的发生而导致缺血性脑卒中。动脉粥样硬化斑块的破裂、血小板聚集及血栓形成是缺血性脑卒中的主要发病机制, 其中斑块的破裂及继发性血栓是最重要的始动环节^[6]。目前普遍认为急性缺血性脑血管事件的发生与否主要取决于粥样斑块的稳定性, 与血管的狭窄程度并无直接关系。而随着对动脉粥样硬化发生、发展研究的深入, 越来越多的证据表明其可能是一种炎症性疾病^[7] 。炎症反应的激活可导致斑块的不稳定, 触发急性缺血性脑卒中的发生。
L-选择素属黏附分子选择素家族的成员之一,表达于所有的中性粒细胞和单核细胞,血液和骨髓中大部分T淋巴细胞、B淋巴细胞、嗜酸粒细胞及一部分自然杀伤细胞(NK)上。主要介导白细胞与内皮细胞间的选择性识别、黏附,在淋巴细胞归巢、白细胞炎性渗出等过程中起重要作用^[8]。而白细胞与内皮细胞的黏附在动脉粥样硬化形成过程中发挥着重要的作用。已有研究表明,L-选择素与动脉粥样硬化过程密切相关。Devaraj S^[9]及我国学者赵学礼等^[10]的研究均发现:2型糖尿病合并大血管病变者与正常对照者相比L-选择素水平显著增高,推测L-选择素可能是糖尿病患者动脉粥样硬化的早期标志物。刘佳^[11]根据自己的研究结果认为 L-选择素与树突状细胞表达的配体相结合后通过TLR4通路促进DCs成熟,促进了动脉粥样硬化的发生和发展。还有研究证实,L-选择素在原发性高血压患者外周血中的表达也显著增高^[12],而高血压已证实是动脉粥样硬化的高危因素。Wei YS等^[13]研究还发现L-选择素基因的P213S多态性及其血清水平均与缺血性脑卒中相关。本研究结果表明,与对照组比较,缺血性脑卒中患者外周血中L-选择素RNA的表达水平明显升高,这提示L-选择素可能与缺血性脑卒中的发病相关。L-选择素可通过介导白细胞沿内皮细胞表面滚动、迁移和黏附,并通过与β2 整合素的黏附加强作用,使白细胞活化、聚集并粘附在内皮表面,从而参与血管炎症的发生发展,促进血管的粥样硬化及斑块形成。而且持续的炎症反应进一步催化了斑块的不稳定性,最终导致缺血性脑卒中的发生。
炎症反应是缺血性脑损伤的重要病理生理机制之一,参与缺血性脑卒中的发生、发展,并与其严重危及生命的并发症相关。本研究结果提示L-选择素可能与缺血性脑卒中的发病有关,为探究缺血性脑卒中的炎症机制提供了线索。