《卒中与神经疾病》杂志 2016年05期
309-313
出版日期：2016-10-26
ISSN:1007-0478
CN:42-1402/R
Wnt3a调控大鼠骨髓间充质干细胞向胆碱能神经元分化的实验研究
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)又称为老年性痴呆,严重影响了老年人的生活能力。流行病学调查显示65岁以上人群中AD的发病率为5%～10%,85岁以上的老年人中发病率增长为25%[1]。随着我国人口老龄化的发展,AD的患病率将逐渐增高,成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。
AD的主要病理特征是β淀粉样蛋白(amyloid-β protein, Aβ)聚集成的老年斑(senile plaque, SP)和过度磷酸化的微管相关蛋白tau蛋白组成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangle, NFT),两者的存在均会产生神经毒性,最终导致海马神经元的大量缺失。在AD早期内源性海马神经前体细胞分裂、增殖、分化为成熟神经元来补充缺失的海马神经元,具有一定的自我修复作用,可以对抗疾病进展[2]。但疾病后期新生的海马神经元数量不断减少,不能得到代偿,最终出现临床症状。如果能纠正海马神经元的缺失,恢复其正常生理结构,将对改善AD症状有重要意义[3]。
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类来源于骨髓的多能干细胞,具有自我更新及多向分化的潜能,目前已成为研究干细胞移植治疗多种疾病的种子细胞。已有研究表明MSCs在特定微环境下能分化为神经干细胞及多种有功能的神经元,并能通过移植改善AD大鼠模型的认知功能。如何调控MSCs向神经干细胞及特定神经元分化成为了研究的难点[4]。相关研究表明Wnt信号通路在神经发生中起着重要的作用 [5]。
本实验通过体外分离及培养SD大鼠的MSCs,利用Wnt3a蛋白及其他诱导分子对MSCs进行干预,观察Wnt3a对MSCs向神经元及胆碱能神经元分化的影响,为干细胞移植治疗阿尔茨海默病提供一定的实验及理论依据。
1 材料与方法
1.1 SD大鼠MSCs的培养、扩增
5周健康雄性SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司; 引颈处死大鼠,无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨,显露骨髓腔; 用10 mL注射器吸取含10%胎牛血清的DMEM培养基,冲出骨髓腔中的细胞,制成单细胞悬液,接种于底面积为25 cm2的培养瓶中,置于37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中培养; 48 h后首次全量换液,以后每3 d全量换液1次,7 d左右细胞生长至融合; 融合后按1:2或1:3比例进行传代培养; 其后一般3 d传代1次。
1.2 细胞生长曲线的绘制
取生长良好的P3代MSCs,消化后按3×104/孔接种于24孔板中,分7组,每组各3个孔; 37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中培养7 d,其间逐日计数一组细胞,取均值,将7 d所得数值绘制成细胞的生长曲线。
1.3 流式细胞仪检测细胞的表面标志物
取生长良好的P4代MSCs,用0.25%胰酶+0.03%EDTA消化后离心,PBS洗3次,MSCs中加入饱和浓度FITC标记的CD11b、CD29、CD44、CD45抗体,室温下避光孵育30 min,再用PBS清洗去除未结合抗体,10 g/L多聚甲醛固定15 min,流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。
1.4 β-catenin蛋白细胞内分布检测
取生长良好的P4代MSCs分为2组,1组为空白对照组,含10%FBS的DMEM培养基培养细胞; 2组为Wnt3a组,用含50 ng/ml Wnt3a蛋白和10%FBS的DMEM培养基培养细胞,用间接免疫荧光和Western-Blot检测β-catenin蛋白的分布变化。抗β-catenin抗体购于英国Abcam公司。
1.5 MSCs向神经元及胆碱能神经元细胞的诱导分化检测
取生长良好的P4代MSCs分为3组,A组为空白对照组,用空白DMEM培养基培养细胞; B组为诱导分化对照组,用含100 ng/ml bFGF、5 umol/L RA的DMEM诱导培养基培养细胞; C组为Wnt3a诱导分化组,在上述诱导培养基中加入50 ng/mLWnt3a蛋白培养细胞。上述3组细胞培养过程中每3 d换液1次,每天于倒置显微镜下观察各组细胞形态的变化并照相; 应用Western-Blot方法鉴定神经元特异性核蛋白(neuron-specific nuclear protein, NeuN)和胆碱乙酰基转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)的表达; 抗ChAT抗体和抗NeuN抗体均购于英国Abcam公司。
1.6 统计学处理
采用SPSS 18.0进行统计学分析,对于正态分布资料使用均数±标准差表示其平均水平。2组均数的比较采用两独立样本的t检验,各组均数的比较采用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 MSCs的形态学及生长特点
利用差速贴壁法进行MSCs原代培养,接种4 h后细胞开始贴壁, 48 h后大量MSCs贴壁,形态为多角形或梭形,7 d左右细胞生长至融合后可传代。原代和P1代细胞呈克隆样生长,一般传代后3 d细胞生长至融合,P2代以后细胞呈均匀分布生长,细胞传至P3代时形态趋于一致,呈短梭形。细胞传至P6、P7代时生长变得缓慢。本研究应用P4代细胞进行后续实验(图1)。
图1MSCs形态学检测(100×倍)
P3代MSCs生长曲线显示,接种后的第1、2 d细胞处于潜伏期,增殖缓慢; 第3、4 d细胞进入对数生长期,增殖旺盛; 第5 d进入平台期,增殖减慢(图2)。
图2SD大鼠MSCs的生长曲线
2.2 MSCs表面标志物的检测
经流式细胞仪检测,体外传代培养的P4代细胞具有较好的均一性。其中绝大部分细胞CD11b、CD34和CD45表达为阴性(阳性率分布为6.6%、4.6%、1.9%),高度表达CD29和CD44,两者阳性率分别为99.9%和73.2%(图3)。
图3流式细胞仪检测P4代MSCs的表面抗原标志
2.3 Wnt3a蛋白处理MSCs细胞后胞内β-catenin的分布变化
应用含50 ng/mL Wnt3a蛋白和10%FBS的DMEM培养基培养MSCs48 h后间接免疫荧光显示Wnt3a组在细胞核的位置可见β-catenin的聚集(图4),而对照组未见β-catenin在细胞核位置聚集。为进一步验证上述结果,采用蛋白核质分离Western-Blot结果显示,经Wnt3a处理48 h后胞核内的β-catenin的含量较对照组显著增多,对照组和实验组胞核内β-catenin/HDAC的比值分别为0.541±0.157和1.181±0.158。2组之间有明显差异(P<0.01)(图5)。
图4间接免疫荧光检测β-catenin在胞内的分布变化Wnt3a组培养48 h后间接免疫荧光显示Wnt3a组在细胞核的位置可见β-catenin的聚集(箭头所示),而对照组未见β-catenin在细胞核位置聚集
图5 Western-Blot检测细胞蛋白核质分离后β-catenin的水平
与空白对照组比较,**P<0.01
2.4 MSCs向神经元及胆碱能神经元诱导分化的检测
将P4代MSCs经不同诱导培养基进行诱导分化7 d后形态学观察显示空白对照组细胞呈梭形,诱导分化对照组和Wnt3a诱导分化组细胞长出突起,呈神经元样细胞,而Wnt3a诱导分化组细胞形态学变化更明显(图6)。
图6MSCs的诱导分化细胞形态改变(200×倍)
诱导分化12 d后应用Western-Blot检测发现,空白对照组可见少量NeuN的表达而未见ChAT的表达,诱导分化对照组和Wnt3a诱导分化组均可见NeuN和ChAT的表达。空白对照组、诱导分化对照组和Wnt3a诱导分化组的NeuN/actin的比值分别为0.218±0.012、0.712±0.042和0.736±0.039,空白对照组与诱导分化对照组,空白对照组与Wnt3a诱导分化组之间有明显差异(P<0.01),而诱导分化对照组与Wnt3a诱导分化组之间无明显差异。Wnt3a诱导分化组较诱导分化对照组的ChAT表达增多,2组ChAT/actin的比值分别为0.208±0.018和0.112±0.012,两组之间有明显差异(P<0.01)(图7)。
3 讨 论
本研究发现,利用差速贴壁法分离纯化的MSCs细胞传至P3代时形态趋于一致,呈均匀分布生长。生长曲线显示接种后的第1、2 d细胞处于潜伏期; 第3、4 d细胞进入对数生长期; 第5 d进入平台期。P4代细胞高度表达CD29和CD44。应用Wnt3a处理MSCs后细胞浆中β-catenin转移至细胞核,细胞形态发生显著变化,NeuN和ChAT的表达显著增多。上述研究发现Wnt3a能够促进体外培养的MSCs向胆碱能神经元分化。
MSCs具有自我更新及多向分化的潜能,在不同的微环境下可以分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元等多种细胞 [6],因此被认为是细胞移植治疗多种疾病的种子细胞[7]。但骨髓中MSCs的含量很低,约占细胞总数的0.001%～0.01%。本实验通过差速贴壁法成功分离培养了MSCs,并对其进行了鉴定,P4代经流式细胞仪检测细胞具有较好的均一性,表达CD29和CD44,而不表达CD11b、CD34和CD45,符合MSCs的特点。细胞生长曲线显示传代后第3、4 d细胞处于对数生长期,增殖旺盛[8]。
已有研究表明MSCs在适当条件下能在体内外诱导分化为多种类型的神经元。但MSCs向神经元分化的调控机制尚未明确。研究表明Wnt信号通路对MSCs的分化有一定的调控作用[9-10]。根据细胞内β连环蛋白(β-catenin)是否参与信号通路,将Wnt信号传导通路分为经典Wnt信号传导通路和非经典Wnt信号传导通路。其中Wnt3a蛋白与细胞膜上的相应受体结合,可以激活经典Wnt信号通路,促进未被磷酸化的β-catenin入核并启动靶基因的转录,产生多种细胞效应 [11]。Ping 等分离正常
图7Western-Blot检测各组细胞神经元NeuN
和胆碱能神经元ChAT的表达水平A组为空白对照组,B组为诱导分化对照组,C组为Wnt3a诱导分化组; 直方图显示各组NeuN/actin和ChAT/actin的比值,与A组比较,**P<0.01; 与B组比较,△P<0.01
人及AD患者皮层的胶质祖细胞(glial progenitor cells, GPCs),研究这些细胞分化为神经元的能力,发现相对于正常人,AD患者的GPC自我更新能力及神经发生能力明显下降,AD患者的GPC中有功能的β-catenin水平显著下降,而即将降解的磷酸化的β-catenin水平增高[12]。表明经典Wnt信号通路对AD患者的神经发生具有一定的调节作用。Wexler 等应用锂剂来激活Wnt通路,能够刺激成年小鼠体内海马前体细胞增殖,并能促进海马前体细胞分化为表达微管相关蛋白β-Ⅲ-Tubulin(Tuj1)的神经元[13]。本实验通过加有Wnt3a蛋白的培养基培养细胞,细胞免疫荧光和Western-Blot检测均证实了Wnt3a蛋白可以促进MSCs的β-catenin入核,说明Wnt3a蛋白可以激活MSCs的经典Wnt信号通路。
通过维甲酸等的诱导作用MSCs可以分化为胆碱能神经元,且分化的胆碱能神经元Wnt3a蛋白表达增加[14]。本实验采取了维甲酸和碱性成纤维细胞因子联合诱导MSCs向胆碱能神经元分化的方法,Wnt3a组另外加入Wnt3a蛋白诱导分化,结果表明3组均有神经元标记物的表达,表明MSCs培养过程中可能存在自然分化现象,但其分化量远少于诱导分化组。相对于空白对照组,维甲酸和碱性成纤维细胞因子联合诱导可以使MSCs向胆碱能神经元分化,并且Wnt3a组对MSCs分化为胆碱能神经元有促进作用。Wnt3a蛋白可以激活MSCs的经典Wnt信号通路,推测经典Wnt信号通路对MSCs向胆碱能神经元分化具有调节作用。
本实验结果证实MSCs在体外诱导条件下可以分化为胆碱能神经元,并且经典Wnt信号通路的激活可以促进这一过程,推测移植经Wnt3a激活的MSCs,在动物体内同样可以促进其向胆碱能神经元的分化,提高MSCs移植治疗阿尔茨海默病的疗效。